КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-20026

НазваниеИсследование механизмов эффективности T клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T) против клеточных и животных моделей солидных опухолей

РуководительРизванов Альберт Анатольевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2022 г.

Конкурс№31 - Конкурс 2019 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Объект инфраструктуры Центр доклинических и трансляционных исследований ФГБУ "НМИЦ им. В.А. Алмазова" Минздрава России.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые словахимерный антигенный рецептор, солидные опухоли, цитокиновый шторм, цитотоксичность, лентивирусы, клеточные модели, ко-культуры, сфероиды, трехмерная биопечать, животные модели

Код ГРНТИ34.15.33

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Иммунотерапия является одной из наиболее перспективных ветвей современной фундаментальной и клинической онкологии. Важность исследований в данной области подчеркивается присуждением Нобелевской премии по медицине и физиологии 2018 года за открытие контрольных точек, отвечающих за противоопухолевый иммунный ответ. Другим известным примером клинически успешной клеточно-опосредованной иммунотерапии онкологических заболеваний является адоптивная Т-клеточная терапия с использованием технологии химерных антигенных рецепторов (CAR). В августе 2017 года в США впервые в мире было получено разрешение на применение препарат Kymriah для лечения резистентного/релапсирующего В-клеточного острого лимфобластного лейкоза у детей. Сразу после этого, в октябре 2017 года последовало аналогичное решение по препарату Yescarta для иммунотерапии взрослых пациентов с некоторыми формами резистентных/релапсирующих крупноклеточных В-клеточных лимфом. Однако, несмотря на успех, CAR-T клеточная терапия оказалась малоэффективной применительно к солидным опухолям (карцинома, нейробластома и др.). Это связано с несколькими причинами, такими как высокая гетерогенность клеточного состава солидных опухолей, агрессивное опухолевое микроокружение, включающее в себя как ингибирующие активность CAR-T лимфоцитов клеточные популяции, так и растворимые факторы с выраженным иммуносупрессивным эффектом, необходимость направленной миграции и проникновения CAR-T клеток против градиента давления в строму опухоли, локальная гипоксия и недостаток питательных веществ внутри опухоли. С учетом высокой распространенности (2 место в структуре смертности) солидных опухолей, решение проблемы применимости CAR-T иммунотерапии является чрезвычайно актуальным. В рамках заявляемого проекта планируется подробно исследовать механизмы действия CAR-T клеток против целого ряда моделей солидных опухолей, включая монослой, ко-культуры, сфероидные структуры, многослойные трехмерные конструкции, а также ксенографтные животные модели. Также будет исследовано участие макрофагов в формировании синдрома цитокиного шторма при взаимодействии с CAR-T клетками. Для выполнения проекта будут получены CAR-T клетки с химерным антигенным рецептором 2-го поколения на основе ранее разработанных последовательностей FMC63-28Z CAR. Научная новизна проекта подтверждается, что тематика применения CAR-T клеток для иммунотерапии солидных опухолей начала набирать интерес в мировой науке лишь в последние несколько лет. Таким образом, реализация проекта позволит российскому коллективу заявителей занять заметную позицию на мировой арене в данной «горячей» области исследования.

Ожидаемые результаты
Ожидается, что по итогам выполнения проекта коллективу заявителей выяснить фундаментальные механизмы действия CAR-T клеток против солидных опухолей. Результаты будут получены путем детального изучения активности СAR-T клеток против ряда моделей солидных опухолей: монослой, сфероиды, трехмерные опухолеподобные структуры, а также ксенографтные опухоли животных. Проблема изучения механизмов адоптивной иммунотерапии солидных опухолей осложнена ограниченным количеством идентифицированных антигенов солидных опухолей, пригодных для таргетирования CAR-T клетками. Использование в данном проекте известной и широко опробированной пары CD19-FMC63 позволит в упрощенном виде смоделировать взаимодействие CAR-T клеток и клеток солидных опухолей. Результаты заявляемого проекта позволят в дальнейшем исследовать активность CAR-T клеток против ряда других антигенов, специфичных для солидных опухолей (HER2, GD2, EGFR и т.д.). Значимость ожидаемых результатов обусловлена тем, что в перспективе полученные данные помогут решить ряд принципиальных проблем в области применения адоптивной иммунотерапии солидных опухолей, таких как: 1) ограниченная эффективность миграции терапевтических клеток в ткань опухоли; 2) наличие в опухоли супрессивного микроокружения.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Получены CAR-T клетки на основе химерного антигенного рецептора 2 поколения, эффективность трансдукции Т-лимфоцитов лентивирусным препаратов оценена по уровню сигнала репортерного белка GFP методом проточной цитофлуориметрии. 2. Иммуномагнитной сепарацией из общей популяции МКПК выделены популяции CD4+ и СD8+ T-клеток. Чистота выделенных популяций определена методом проточной цитофлуориметрией. 3. Получены солидные опухолевые линии РС-3М(Kat+) и РС-3М(Kat+СD19+). Эффективность трансдукции клеток РС-3М лентивирусом, кодирующим красный флуоресцентный белок Katushka2S и CD19 определена методом проточной цитофлуориметрии. 4. Проведена оценка эффективности CAR-T клеток против 2D моделей опухолевых линий. При динамическом наблюдении в монослое клеток PC-3М(Kat+CD19+) наблюдалось снижение их конфлюентности. 5. Проведена оценка эффективности CAR-T клеток против трехмерных опухолеподобных (3D) моделей опухолевых линий. Выявлено, что глубина проникновения CAR-T клеток в 3D структуры, образованные клетками PC-3М(Kat+CD19+), достоверно выше, чем в контрольном образце с клетками PC-3М(Kat+). 6. Проведена оценка эффективности CAR-T клеток против опухолевых сфероидов. Показано, что через 24 часа после добавления CAR-T к PC-3M(Kat+CD19+) клеткам происходит снижение количества опухолевых клеток в сфероидах. При этом, в контрольном образце количество опухолевых клеток PC-3M(Kat+) не изменяется. 7. Проведено in vivo исследование действия CAR-T клеточной терапии на мышиной модели ксенографтной опухоли PC-3M(Kat+CD19+). При помощи системы in vivo имиджинга IVIS Spectrum проведена прижизненная визуализация опухолей путем оценки интенсивности свечения флуоресцентного белка Katushka2S. У ряда мышей контрольной группы и экспериментальной групп флуоресценция наблюдалась также вне опухоли, что свидетельствует о наличии метастазов (также подтверждено гистопатологически). 8. Методом иммуномагнитной сепарации проведено выделение моноцитов из общей популяции МКПК с последующей дифференцировкой в макрофаги М1 и М2 типа. Чистота выделенных популяций определена методом проточной цитофлуориметрии. 9. Проведено ко-культивирование полученных макрофагов М1 и М2 с CAR-T клетками в присутствии и отсутствии опухолевых клеток PC-3M(Kat+CD19+). В присутствии CAR-T клеток выявлено снижение количества опухолевых клеток. 10. Проведен мультиплексный анализ собранных супернатантов после ко-культивирования различных моделей опухолей с CAR-T клетками. Оценено изменение уровня ряда цитокинов, в том числе задействованных в «цитокиновом шторме». Кроме того проведен мультиплексный анализ сыворотки крови мышей после in vivo исследования эффективности CAR-T терапии на модели ксенографтной опухоли предстательной железы PC-3M(Kat+CD19+).

Публикации

1. Алексей Титов, Айгуль Валиуллина, Екатерина Змиевская, Екатерина Зайкова, Алексей Петухов, Регина Мифтахова, Эмиль Булатов, Альберт Ризванов Advancing CAR T-cell therapy for solid tumors: lessons learned from lymphoma treatment Cancers, - (год публикации - 2019)

2. А.Х. Валиуллина, Р.М. Саярова, Е.А. Змиевская, М.О. Гомзикова, М.Н. Журавлева, А.В. Петухов, Э.Р. Булатов, А.А. Ризванов Evaluating CAR-T cells efficiency against solid tumors models ESGCT 27th Annual congress abstract book, - (год публикации - 2019)

3. А.Х. Валиуллина, Р.М. Саярова, М.О. Гомзикова, М.Н. Журавлева, А.В. Петухов, Э.Р. Булатов, А.А. Ризванов Разработка 3D опухолевых моделей для CAR-T терапии солидных опухолей Acta Naturae, - (год публикации - 2019)

4. - ПОБЕДИТЕЛЬ КОНКУРСА ПО ОНКОИММУНОЛОГИИ ИЗУЧИТ МЕХАНИЗМЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ НОВОГО МЕТОДА КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ Сайт Ракфонда, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках выполнения проекта по оценке эффективности CAR-T клеток против солидных опухолей были получены 2D модели и сфероиды на основе линий эпидермоидной карциномы А431, немелкоклеточного рака легкого Н522, карциномы молочной железы MDA231 и MCF7, карциномы предстательной железы PC-3M. Данные линии также были генетически модифицированы для экспрессии антигена CD19 и красного флуоресцентного белка Katushka. Эффективность CAR-T клеток против описанных моделей солидных опухолей продемонстрирована с применением методов MTS теста, биосенсорного клеточного анализа в режиме реального времени, проточной цитофлуориметрии, флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Помимо этого с помощью мультиплексного анализа качественно и количественно оценено изменение цитокинового/хемокинового профиля при ко-инкубации CAR-T клеток с указанными моделями солидных опухолевых линий. Результаты исследования будут востребованы в области разработки отечественных CAR-T биомедицинских клеточных продуктов для иммунотерапии опухолевых заболеваний.

Публикации

1. Алексей Титов, Екатерина Змиевская, Ирина Ганеева, Айгуль Валиуллина, Алексей Петухов, Айгуль Рахматуллина, Регина Мифтахова, Михаил Файнштейн, Альберт Ризванов, Эмиль Булатов Adoptive immunotherapy beyond CAR T-cells Cancers, - (год публикации - 2020)

2. Екатерина Змиевская, Айгуль Валиуллина, Ирина Ганеева, Алексей Петухов, Альберт Ризванов, Эмиль Булатов Application of CAR-T cell therapy beyond oncology: autoimmune diseases and viral infections Biomedicines, - (год публикации - 2020)

3. А. Рахматуллина, А. Валиуллина, А. Петухов, М. Золотых, Э. Булатов, Р. Мифтахова, А. Ризванов Anti-CD19 CAR-T cells show pronounced effect on PC3M-CD19 tumor spheres European Journal of Clinical Investigation, Eur J Clin Invest. 2020;50(Suppl. 1):83-83 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1111/eci.13369

4. Валиуллина А.Х., Змиевская Е.А., Рахматуллина А.Р., Журавлева М.Н., Петухов А.В., Мифтахова Р.Р., Ризванов А.А., Булатов Э.Р. Исследование эффективности CAR-T-клеток против ряда in vitro опухолевых моделей Сборник тезисов XXI Зимней молодежной школы по биофизике и молекулярной биологии, - (год публикации - 2020)

5. Екатерина Змиевская, Айгуль Валиуллина, Маргарита Журавлева, Айгуль Рахматуллина, Ирина Ганеева, Екатерина Зайкова, Алексей Петухов, Регина Мифтахова, Альберт Ризванов, Эмиль Булатов The Effect of Macrophage Polarization on Cytokine Release in CAR-T Antitumor Response Blood, Blood (2020) 136 (Supplement 1): 22 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1182/blood-2020-140980

6. Змиевская Е.А., Валиуллина А.Х., Журавлева М.Н., Петухов А.В., Мифтахова Р.Р., Ризванов А.А., Булатов Э.Р. Исследование влияния макрофагов на секрецию цитокинов при кокультивации с CAR-T-клетками Сборник тезисов XXI Зимней молодежной школы по биофизике и молекулярной биологии, - (год публикации - 2020)

7. - РЕЗУЛЬТАТЫ ПОДДЕРЖАННОГО РАКФОНДОМ ИССЛЕДОВАНИЯ БУЛАТОВА Э.Р. Сайт Ракфонда, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках выполнения проекта проведен комплекс научных работ по оценке цитотоксических функций CAR-T клеток против опухолевых моделей на основе перевиваемых клеточных линий и первичных опухолевых клеток. В частности, оценена эффективность CAR-T клеток против трехмерных моделей опухолевых клеток, а также моно- и гетерогенных сфероидов. Проанализирована жизнеспособность и сравнительная эффективность цитотоксических свойств CAR-T клеток в условиях гипоксии и нормоксии. Для всех образцов проведен мультиплексный анализ цитокинового и хемокинового профиля. Важной частью работы стала оценка эффективности CAR-T клеток против первичных опухолевых клеток пациентов in vitro. Результаты исследования будут востребованы в области разработки отечественных CAR-T биомедицинских клеточных продуктов для иммунотерапии опухолевых заболеваний.

Публикации

1. А.Х. Валиуллина, Е.А. Змиевская, А.Р. Рахматуллина, М.Н. Журавлева, Е.Е. Гаранина, Р.Р. Мифтахова, А.В. Петухов, А.А. Ризванов, Э.Р. Булатов Оценка цитотоксичности CAR-T клеток против модели карциномы предстательной железы Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки, - (год публикации - 2022)

2. Алексей Титов, Ярослав Каминский, Ирина Ганеева, Екатерина Змиевская, Айгуль Валиуллина, Айгуль Рахматуллина, Алексей Петухов, Регина Мифтахова, Альберт Ризванов, Эмиль Булатов Knowns And Unknowns About CAR-T cell Dysfunction Cancers, - (год публикации - 2022)

3. Филин И., Соловьева В., Китаева К., Рутланд К., Ризванов А. Current Trends in Cancer Immunotherapy Biomedicines, Filin IY, Solovyeva VV, Kitaeva KV, Rutland CS, Rizvanov AA. Current trends in cancer immunotherapy. Biomedicines. 2020 Dec;8(12):621 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/biomedicines8120621

4. А.Х. Валиуллина; Е.А. Змиевская; Р.Р. Мифтахова; А.Р. Рахматуллина; М.Н. Журавлева; А.В. Петухов; А.А. Ризванов; Э.Р. Булатов Оценка эффективности Т клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T) против клеточных и животных моделей солидных опухолей Сборник тезисов докладов Х Российского симпозиума "Белки и пептиды" под редакцией акад. А.Г. Габибова и М.А. Островского, А.Х. Валиуллина, Е.А. Змиевская, Р.Р. Мифтахова, А.Р. Рахматуллина, М.Н. Журавлева, А.В. Петухов, А.А. Ризванов, Э.Р. Булатов. Оценка эффективности Т клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T) против клеточных и животных моделей солидных опухолей. (год публикации - 2021)

5. Валиуллина А., Змиевская Е., Ганеева И., Журавлева М., Рахматуллина А., Петухов А., Мифтахова Р., Ризванов А., Булатов Э. Development of in vitro models for evaluating CAR‐T cell therapy against solid tumors Molecular Biology of the Cell, A. Valiullina, E. Zmievskaya, I. Ganeeva, M. Zhuravleva, A. Rakhmatullina, A. Petukhov, R. Miftakhova, A. Rizvanov, E. Bulatov. Development of in vitro models for evaluating CAR‐T cell therapy against solid tumors. Mol Biol Cell 31, 26, #11 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1091/mbc.E20-10-0665

6. Валиуллина А., Змиевская Е., Журавлева М., Петухов А., Ризванов А., Булатов Э. Evaluation of CAR-T cells cytotoxic efficacy against 3D cell-based model of solid tumor European Journal of Clinical Investigation, Valiullina A, Zmievskaya E, Zhuravleva M, Petukhov A, Rizvanov A, Bulatov E. Evaluation of CAR-T cells cytotoxic efficacy against 3D cell-based model of solid tumor. EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 2021 Jun 1 (Vol. 51, pp. 129-130). (год публикации - 2021)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Получены и охарактеризованы NKG2D CAR-T клетки. 2. Получены модифицированные опухолевые клеточные линии А549 и РC3M, несущие NKG2D лиганды. Получена модифицированная опухолевые клеточная линия РC3M, с нокдауном по NKG2D лигандам. 3. Оценена эффективность NKG2D CAR-T-клеток против опухолевых клеточных линий А549, А549(MICA+), PC3M, PC3M(MICA+), PC3M(ULBPs–) 4. Оценена эффективность NKG2D CAR-T клеток против трехмерных опухолеподобных структур на основе клеточной линии РС3М, созданных с помощью 3D-биопринтера INKREDIBLE (CELLINK). 5. Оценена способность проникновения (миграции) NKG2D CAR-T-клеток в трехмерную клеточную модель РС3М, выращенную с помощью картриджного биореактора Vitvo (Rigenerand). 6. Оценена эффективность NKG2D CAR-T клеток против первичных опухолевых клеток пациентов in vitro. 7. Оценена цитотоксичность NKG2D CAR-T-клеток против моно- и гетерогенных сфероидов (образованных опухолевыми клеточными линиями и клетками опухолевого микроокружения). 8. Оценена жизнеспособность и эффективность цитотоксических свойств NKG2D CAR-T клеток против опухолевых клеток в условиях гипоксии. 9. Оценен цитокиновый и хемокиновый профиль супернатантов после ко-культивирования CAR-T клеток с опухолевыми клетками различного происхождения.

Публикации

1. А.Х. Валиуллина, Е.А. Змиевская, А.Р. Рахматуллина, М.Н. Журавлева, Е.Е. Гаранина, Р.Р. Мифтахова, А.В. Петухов, А.А. Ризванов, Э.Р. Булатов Оценка цитотоксичности CAR-T-клеток против модели карциномы предстательной железы Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки, Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. 2022;164(2):212-30. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.26907/2542-064X.2022.2.212-230

2. Алексей Титов, Ярослав Каминский, Ирина Ганеева, Екатерина Змиевская, Айгуль Валиуллина, Айгуль Рахматуллина, Алексей Петухов, Регина Мифтахова, Альберт Ризванов, Эмиль Булатов Knowns And Unknowns About CAR-T cell Dysfunction Cancers, Cancers. 2022; 14(4):1078 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/cancers14041078

3. А. Валиуллина, Е. Змиевская, К. Левчук, А. Петухов, А. Ризванов, Э. Булатов Functional assessment of cytotoxic activity of NKG2D CAR-T cells EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 2022 Jun 1 (Vol. 52) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13796

4. А.Х. Валиуллина, Е.А. Змиевская, Р.Р. Мифтахова, А.Р. Рахматуллина, М.Н. Журавлева, А.В. Петухов, А.А. Ризванов, Э.Р. Булатов Оценка эффективности T клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T) против клеточных и животных моделей солидных опухолей VII Съезд биохимиков России и Х Российский симпозиум "Белки и пептиды"., VII Съезд биохимиков России и Х Российский симпозиум "Белки и пептиды". Сборник тезисов. 2022 (год публикации - 2022)

5. Е. Змиевская, А. Валиуллина, К. Левчук, А. Петухов, А. Ризванов, Э. Булатов Molecular design of novel NKG2D chimeric antigen receptor and its ligands EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 2022 Jun 1 (Vol. 52). (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13796

6. Е. Змиевская, С. Мухаметшин, А. Валиуллина, И. Ганеева, Э. Булатов, А. Ханнанов Obtaining microvesicles from T-lymphocytes using various methods of induction Annals of Oncology, Annals of Oncology. 2022 Oct 1;33:S1408. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2022.09.083

Возможность практического использования результатов
не указано